Набір для аналізу цитотоксичності LDH

 

Назва продукту	кішка немає	спец.
Набір для аналізу цитотоксичності LDH	G1610-100T	100T

 

 

Лактатдегідрогеназа (ЛДГ) є кінцевим ферментом гліколітичного шляху, який широко зустрічається у тварин, рослин і мікроорганізмів і бере участь у каталізі оборотної реакції між піруватом і лактатом. Зазвичай LDH міститься у великій кількості в цитоплазмі клітин, і нормальні клітини не можуть вільно пропускати внутрішньоклітинний LDH через клітинну мембрану через бар’єрний захист клітинної мембрани. Однак, коли клітини пошкоджуються або гинуть, бар’єрний захист клітинної мембрани зникає, і внутрішньоклітинний ЛДГ вивільняється в культуральне середовище. Цитотоксичність можна визначити кількісно шляхом виявлення кількості LDH, що виділяється в культуральне середовище через розрив клітинної мембрани.

 

Основним принципом набору для виявлення цитотоксичності лактатдегідрогенази (ЛДГ) є використання ЛДГ для відновлення NAD+ до NADH, а потім NADH і INT (сіль тетразолію), каталізованих діафоразою (дегідрогеназа ліпоєвої кислоти), для отримання NAD+ і червоного бруду, кількості бруду. і кількість ЛДГ є лінійною кореляцією, і може створити пік поглинання при 490 нм. Пік поглинання при 490 нм, тому його можна кількісно аналізувати приладом. Цей набір в основному використовується для аналізів цитотоксичності на основі вивільнення ЛДГ як індикатора, але також може використовуватися для аналізів клітинної проліферації та токсичності на основі загального клітинного ЛДГ.

 

 

Судно з мокрим льодом; Зберігати при температурі -20 градусів до 12 місяців. Уникайте повторного заморожування-розморожування розчину ферменту. ІНТ Розчин слід захищати від світла.

 

 

Номер компонента	компонент	G1610-100T
G1610-1	10× буфер для лізису клітин	1,5 мл
G1610-2	Субстрат реакції	2×1 мл
G1610-3	INT Рішення	200 μL
G1610-4	Розчин ферменту	2×150 μL
G1610-5	Буфер реакції	10 мл
Інструкція		Один примірник

 

 

1. Підготовка зразка:

1) Виявлення позаклітинної ЛДГ

a. Посів клітин: посів клітин у 96-планшет з лунками для культури клітин на відповідний час залежно від типу клітин. Злиття клітин, що підлягають тестуванню, має перевищувати 80-90%. І кілька елементів керування можна встановити відповідно до експериментальних вимог.

фоновий контроль: містить лише культуральне середовище без клітин.

контрольний зразок: містить культуральне середовище та клітини. Необроблені клітинні лунки.

Контроль максимальної ферментативної активності проби: містить культуральне середовище та клітини. Виявлення загальної внутрішньоклітинної LDH після лізису необроблених клітин

Оброблений зразок (експериментальна група): відповідно до бажаного методу обробіть клітини відповідним препаратом у різних концентраціях.

b. Обробка клітин: видаліть культуральне середовище та один раз промийте клітини розчином PBS (рекомендовано G4202). Додайте свіже культуральне середовище (культуральне середовище з низьким вмістом сироватки, безсироваткове або з лікарським вмістом) у кожну лунку, інкубуйте протягом певного періоду.

в. Збір зразків: центрифугуйте чашку для культури клітин при 1,000×g протягом 5 хв. Перенесіть 80 мкл супернатанту з кожної лунки в новий 96-лунковий планшет, після чого зразки були проаналізовані. Підготовка зразка для контрольної лунки з максимальною ферментативною активністю зразка, будь ласка, зверніться до етапів підготовки зразка для загальної внутрішньоклітинної LDH аналіз).

2) Виявлення загальної внутрішньоклітинної ЛДГ

a. Посів клітин: клітини інокулюють у 96-планшети для культури клітин з ямками відповідної щільності, і можна створювати кілька підгруп відповідно до експериментальних потреб;

b. Обробка клітин: відповідно до плану експерименту використовуйте середовище, що містить або не містить ліки (може містити сироватку), для інкубації клітин;

в. Лізис клітин: після досягнення заданого часу видаліть вихідне середовище, промийте його один раз PBS, додайте 120 мкл робочого розчину для лізису клітин (10× розчин для лізису клітин, розведений у 10 разів PBS) та інкубуйте в інкубаторі {{3 }} хв ;

d. Збір зразків: центрифугуйте планшет для культури клітин при 1,000× g протягом 5 хвилин і додайте 80 мкл супернатанту лізису в новий 96-планшет з лунками, а потім проведіть аналіз.

3) (Додатково) Підготовка стандартної проби LDH

Якщо потрібне абсолютне кількісне визначення активності ферменту ЛДГ, придбайте стандарт ЛДГ окремо та підготуйте стандарти ЛДГ у різних концентраціях: 10 мОд/мл, 5 мОд/мл, 2,5 мОд/мл, 1,25 мОд/мл, {{8 }}.65 мОд/мл і 0 мОд/мл. При 80 мкл на лунку градієнт додавали до 96-лункового планшета.

2. Виявлення LDH:

1) Відповідно до кількості зразків, які потрібно перевірити, зверніться до таблиці нижче, щоб підготувати відповідну кількість робочого розчину для виявлення LDH.

Примітка: він відповідає 96-планшету з лунками, а для інших характеристик планшетів із лунками можна налаштувати за потреби);

 

	1 Зразок	10 зразків	20 зразків	50 зразків
Субстрат реакції	20 μL	200 μL	400 μL	1 мл
INT Рішення	2 μL	20 μL	40 μL	100 μL
Розчин ферменту	3 μL	30 μL	60 μL	150 μL
Буфер реакції	55 μL	550 μL	1,1 мл	2,75 мл
Загальний обсяг	80 μL	800 μL	1,6 мл	4 мл

 

2) Додайте 80 мкл робочого розчину ЛДГ до 80 мкл надосадової рідини в 96-лунковий планшет, підготовлений на кроці 1 (Vзразок: робочий розчин для виявлення VLDH=1:1), перемішайте обережним постукуванням.

3) Клітини інкубували в інкубаторі для культур клітин, захищеному від світла протягом 30 хв, або загортали в олов’яну фольгу та інкубували на горизонтальному шейкері протягом 30 хв при кімнатній температурі;

4) Виміряйте оптичну густину всіх контролів і зразків за допомогою планшет-рідера при 490 нм. Еталонна довжина хвилі повинна бути 600 нм або більше.

3. Розрахунок результату LDH:

1) Стандартний аналіз цитотоксичності LDH (вивільнення):

a. Відніміть OD490 фонового контролю з OD490 контролю зразка, контролю максимальної активності ферменту зразка, оброблених лунок зразка тощо та використовуйте їх для наступних розрахунків.

b. Розрахунок цитотоксичності або рівня смертності (%)=(OD490 обробленого зразка - OD490 контрольного зразка) / (OD490 максимальної активності ферменту контрольного зразка - OD490 контрольного зразка) × 100%

2) Відносна кількісна оцінка активності ферменту LDH (згідно з результатами розрахунку можна порівняти, чи є статистичні відмінності між різними групами лікування зразків тощо):

a. Визначити OD490 відомої концентрації стандарту LDH;

b. Активність ЛДГ досліджуваного зразка (мОд/мл)=(OD490 лунки для зразка - OD490 лунки для фонового порожнього контролю) / (OD490 стандартного продукту - OD490 лунки для фонового порожнього контролю) × стандартна концентрація (мU /мл)

3) Абсолютна кількісна оцінка ферментативної активності ЛДГ:

a. Виміряйте OD490 серії градієнтних стандартних продуктів LDH, намалюйте стандартну криву відповідно до отриманого значення абсорбції та обчисліть формулу тенденції: Y(OD490)=A × одиниця активності LDH (мОд)+B, тренд можна обчислити програмним забезпеченням, таким як Excel, нахил і перетин лінії;

b. Активність ЛДГ у системі виявлення (мОд)=(ЗО лунки для зразка490-ЗП лунки для контрольної фонової проби490-B)/A

в. Активність LDH зразка (мОд/мл)=Активність ЛДГ у системі виявлення (мОд) / об’єм виявлення (мл)

 

 

1. Щільність клітин не повинна перевищувати 85% або більше, такі фактори, як стан клітин і щільність клітин, матимуть певний вплив на клітинне вивільнення LDH, і зразки підготовлені, спробуйте завершити тест в той же день, не заморожувати.

2. Сироватка містить лактатдегідрогеназу, рекомендується використовувати безсироваткове середовище або середовище з низьким вмістом сироватки, якщо вам потрібно використовувати 10% сироватки, будь ласка, створіть безклітинну контрольну групу, щоб усунути фонові перешкоди.

3. Операція максимально щадна, і слід уникати бульбашок, щоб не вплинути на результати експерименту.

4. Для вашої безпеки та здоров'я, будь ласка, одягайте захисні окуляри, рукавички або захисний одяг.

 

Тільки для дослідницького використання!

 

 

Популярні Мітки: набір для аналізу цитотоксичності ldh, Китай виробники, постачальники, фабрика набору для аналізу цитотоксичності ldh