Набір для аналізу клітинної проліферації Click-iT EdU-555

 

назва продукту	Ідентифікація товару	модель
Набір для аналізу клітинної проліферації Click-iT EdU-555	G1602	100T

 

 

Аналіз здатності клітин до проліферації є поширеним і важливим методом оцінки в науках про життя. Він може судити про вплив певних генів, ліків тощо на клітини, культивовані in vitro, або аналізувати здатність до росту та оновлення клітин тканини за різних умов або стимуляції. В даний час існує багато методів виявлення клітинної проліферації. Більшість із них використовують деякі метаболічні ферменти, що виробляються клітинами, для опосередкованої оцінки активності клітинної проліферації (наприклад, метод CCK-8, метод MTT тощо), але деякі препарати чи стан самої клітини матимуть певний вплив на результати оцінювання. Пряме виявлення синтезу ДНК у клітинах для визначення клітинної проліферації визнано найбільш точним і ефективним методом виявлення. Однак і оригінальний метод включення радіомічених нуклеозидів, і подальше вдосконалення методу BrdU на основі виявлення антитіл мають свої обмеження.

EdU (5-Етиніл-2'-дезоксиуридин, 5-етиніл-2'-дезоксиуридин) є аналогом тимідину, що містить ацетиленову групу, якщо його вводять тваринам або інкубують клітини, культивовані в У лабораторних умовах ці малі молекули можуть швидко дифундувати до різних органів і тканин, проникати в клітини та замінювати тимідин. (T) у новосинтезовану ДНК під час проліферації клітин. Ацетиленова група в молекулі EdU може реагувати з флуоресцентно міченим iF488 зондом азидної сполуки з утворенням стабільного триазольного кільця під дією каталізу іонів міді, тому новосинтезовану ДНК можна позначити відповідним флуоресцентним зондом. У порівнянні з методом включення радіомічених нуклеозидів, метод виявлення EdU не має обмежуючих факторів, таких як радіоактивне забруднення; У порівнянні з методом виявлення BrdU, метод виявлення EdU не вимагає денатурації ДНК або реакції антиген-антитіло, що значно зменшує складність експерименту, а також робить експеримент більш економним, чутливішим, стабільнішим і точнішим.

Цей набір можна використовувати для виявлення клітинної проліферації в культивованих клітинах або тканинах тварин. Флуоресцентний зонд у цьому наборі — червоний флуоресцентний, максимальна довжина хвилі збудження — 557 нм, а максимальна довжина хвилі випромінювання — 570 нм. Після того, як проліферуючі клітини будуть помічені, ядро ​​клітини буде показувати яскраво-червону флуоресценцію, а ядро ​​клітини буде спільно позначено відповідним звичайним ядерним барвником (цей набір містить клітинний ядерний барвник Hoechst 33342), ви можете використовувати флуоресцентний мікроскоп, лазерний конфокальний мікроскоп та інші інструменти для безпосереднього спостереження за проліферацією клітин; Ви також можете використовувати проточну цитометрію для визначення інтенсивності флуоресценції культивованих клітин in vitro, а потім визначити клітинний цикл на основі інтенсивності флуоресценції активності реплікації ДНК у середині фази S.

 

 

Транспортування мокрим льодом; Каталітичний реагент EdU (реагент A) і реакційний буфер можна зберігати при 4 градусах, дійсний протягом 12 місяців.

 

 

Номер компонента	компонент	G1602-100T
G1602-1	Розчин для зберігання EdU (10 мМ)	100 μL
G1602-2	Каталітичний реагент (Реагент А)	120 μL
G1602-3	Флуоресцентний барвник iF555 (реагент B)	50 μL
G1602-4	Каталітична добавка (Реагент С)	2×100 мг (порошок)
G1602-5	Буфер реакції	20 мл
G1602-6	Розчин для фарбування Hoechst 33342	30 μL
Інструкція		Один примірник

 

 

1. Середовище клітинної культури, що містить сироватку;

2. Реагент для пермеабілізації:0.2%- 0.5% Triton® X-100 у PBS (G1204);

3. Фіксатор: 4% параформальдегід (G1101) або інші подібні реагенти;

4. Фосфатний буферний розчин (PBS);

5. Надчиста вода;

6. Моделювання тварин і реагенти, пов’язані з зрізами тканин (виявлення проліферації клітин тканин тварин)

 

 

1. Попередня обробка культивованих клітин in vitro:

1.1. Рівномірно висаджуйте клітини в культуральний планшет із певною щільністю (щільність посіву визначається такими факторами, як розмір клітини, швидкість росту тощо). Після того, як клітини прилипнуть до стінки або повернуться до нормального стану, виконайте відповідну медикаментозну стимуляцію та інші процедури. (Для суспензійних клітин дотримуйтеся звичайного методу роботи суспензійних клітин. Весь експеримент потребує додавання центрифугування та інших етапів).

1.2. Каталітичну добавку (реагент C) центрифугували на низькій швидкості, брали 100 мг і розчиняли, додаючи 1 мл надчистої води, розподіляли та зберігали при -20 градусах, порошок, що залишився, зберігався як резерв.

2. In vitro клітинне маркування EdU, фіксація та пермеабілізація:

2.1. Приготуйте робочий розчин для інкубації 2 × EdU: додайте 2 мкл розчину для зберігання EdU (10 мМ) до кожного 1 мл повного середовища для культивування клітин, що становить 20 мкМ робочого розчину для інкубації 2 × EdU, і помістіть його в інкубатор для попереднього нагрівання (рекомендовано Робоча концентрація EdU становить 10 мкМ для попередніх експериментів);

2.2. У режимі напівзміни аспіруйте половину вихідного культурального середовища клітин у культуральний планшет і додайте рівний об’єм попередньо нагрітого робочого розчину для інкубації 2×EdU та інкубуйте протягом певного періоду часу (тривалість інкубації зазвичай залежить від на цикл росту відповідних клітин, на який зазвичай припадає близько 10% клітинного циклу, для переважно приклеєних і швидко зростаючих клітин інкубація становить близько 2 рекомендовано h.У конкретних випадках його потрібно скоригувати з урахуванням характеристик клітини, фактичної ситуації після лікування тощо концентрація може бути відповідно збільшена);

2.3. Після інкубації EdU промийте PBS-буфером протягом 1-2 разів, додайте фіксуючу рідину, щоб покрити клітини, і зафіксуйте при кімнатній температурі протягом 15 хвилин (якщо потрібна проточна цитометрія, прилиплі клітини слід переварити та ресуспендувати перед цим етапом фіксуйте, дотримуйтеся методу обробки клітин суспензії); Промийте 2-3 разів буфером PBS, 3-5 хв кожного разу;

2.4. Видаліть буфер PBS, додайте розчин для пермеабілізації, щоб покрити клітини, та інкубуйте при кімнатній температурі протягом 15 хвилин;

2.5. Видаліть пермеабілізуючий розчин, промийте 1-2 разів буфером PBS, 3-5 хв кожного разу. Потім перейдіть до кроку 4.

3. Ін'єкційне моделювання Animals EdU, а також обробка зрізів тканин:

3.1. Згідно з експериментальними вимогами, одна або кілька ін’єкцій EdU використовуються для моделювання тварин шляхом внутрішньоочеревинної ін’єкції, внутрішньом’язової ін’єкції, підшкірної ін’єкції, ін’єкції в хвостову вену тощо. Зазвичай співвідношення дози EdU до маси тіла тварини становить 5 мг/кг, фактична Доза введення залежить від досліджуваного змісту та умов тваринного. Розчин для зберігання EdU, наданий у цьому наборі, в основному використовується для маркування клітин EdU in vitro. Якщо вам потрібно змоделювати тварину за допомогою EdU, ви можете замовити реагент EdU окремо (Кат. №: G5059);

3.2. Епітеліальні клітини, такі як тонка кишка, розмножуються швидко, тоді як клітини головного мозку розмножуються повільно. Для мічення тканин, що ростуть швидше, зазвичай потрібно менше 12 годин, тоді як для мічення тканин, що ростуть повільніше, може знадобитися кілька днів. Оптимальний час мічення було визначено відповідно до конкретного експерименту. Через швидку проліферацію кишкової епітеліальної тканини така тканина була рекомендована як еталон для маркування.

3.3. Після того, як тварину вбивають відповідно до визначених стандартів, необхідні тканини виймають і заморожені зрізи або парафінові зрізи виготовляють згідно з традиційними процедурами:

a. Для заморожених зрізів: поверніть зрізи до кімнатної температури, додайте відповідну кількість фіксуючої рідини та зафіксуйте при кімнатній температурі протягом 15 хвилин. Видаліть фіксуючу рідину та промийте 3 рази буфером PBS протягом 3-5 хв кожен; видаліть буфер PBS і накрийте тканину відповідною кількістю розчину для пермеабілізації та інкубуйте при кімнатній температурі протягом 10-15 хв; видаліть пермеабілізуючий розчин і промийте буфером PBS 1- 2 разів, 3-5 хв кожного разу. Потім перейдіть до кроку 4.

b. Для парафінових зрізів: депарафінізуйте та повторно гідратуйте зрізи та промийте PBS протягом 5 хв. Видаліть буфер PBS, додайте пермеабілізуючий розчин, щоб покрити клітини або тканини, та інкубуйте при кімнатній температурі протягом 15 хвилин; Потім промийте буфером PBS 1-2 разів, кожного разу протягом 3-5 хв. Потім перейдіть до кроку 4.

4. Реакція на натискання EdU:

4.1. Під час фіксації клітин або тканин і перфорації приготування реакційного розчину: змішайте реагенти відповідно до наступного співвідношення, об’єм препарату можна збільшити або зменшити пропорційно кількості зразків.

 

компонент	Обсяг (для комірки)	Об'єм (для гістологічного зрізу)
реакційний буфер	935 μL	928 μL
Реагент А	10 μL	10 μL
Реагент B (барвник iF555)	5 μL	12 μL
Реагент С	50 μL	50 μL
загальна місткість	1000 μL	1000 μL

 

4.2. Видаліть буфер PBS з клітин або зрізів, додайте реакційний розчин, обережно струсіть, щоб переконатися, що реакційний розчин покриває всі клітини або тканини, та інкубуйте протягом 30 хвилин при кімнатній температурі в темряві;

4.3. Видаліть реакційний розчин, промийте 2-3 раз буфером PBS, 3-5 хв кожного разу (якщо немає інших спеціальних вимог, інтенсивність флуоресценції можна визначити за допомогою проточної цитометрії або ефект флуоресценції можна виявити за допомогою інші інструменти).

5. Ядерна фарба (за бажанням):

5.1. Розведіть фарбувальний розчин Hoechst 33342 буфером PBS у співвідношенні 1:500-1000, додайте до зразка, щоб покрити клітини, та інкубуйте протягом 5 хвилин;

5.2. Видаліть фарбувальний розчин Hoechst 33342, промийте 2-3 разів буфером PBS, 3-5 хв кожного разу.

6. Зображення та аналіз виявлення:

Використовуйте флуоресцентний мікроскоп або конфокальний мікроскоп для виявлення оброблених клітин або зразків зрізів тканини та аналізу частки проліферуючих клітин. Крім того, можна зібрати клітини, культивовані in vitro, і виміряти інтенсивність флуоресценції за допомогою проточної цитометрії (рекомендовано використовувати зразки клітин, не мічені EdU, як негативний контроль для проточної цитометрії та вибрати відповідну напругу) і на основі за інтенсивністю флуоресценції можна визначити активність реплікації ДНК S-фази в клітинному циклі. Флуоресцентний барвник if555 (реагент B) у цьому наборі відповідає спектральним характеристикам Ex/Em: 557 нм/570 нм (червоний); Розчин для фарбування Hoechst 33342 відповідає спектральним характеристикам Ex/Em: 346 нм/460 нм (синій).

 

 

1. Для культивованих клітин конкретну концентрацію EdU та час інкубації можна регулювати належним чином залежно від зразка та мети дослідження.

2. Деякі клітини тканин розмножуються повільно. Щоб уникнути поганого ефекту моделювання, рекомендується відбирати зразки тканин із швидкою проліферацією як еталонні зразки (наприклад, кишкова тканина).

3. Якщо фоновий колір занадто темний, це може бути спричинено недостатнім промиванням, тривалим часом фіксації та залишками фіксатора тощо під час експерименту.

4. Реагент C (каталітичний додатковий реагент EdU) легко окислюється. Намагайтеся уникати тривалого перебування на повітрі. Після приготування у вигляді водного розчину рекомендується зберігати в аліквотах; Випробувано, наприклад, колір реагенту каталітичної добавки EdU дещо змінюється, каталітична система реакції клацання все ще може працювати нормально. якщо реагент C виглядає коричневим, це означає, що термін придатності компонента закінчився, тому викиньте його.

5. Для вашого здоров'я та безпеки під час роботи надягайте лабораторні халати та рукавички.

 

Тільки для дослідницького використання!

 

 

Популярні Мітки: набір click-it edu-555 для аналізу проліферації клітин, Китай click-it edu-555 набір для аналізу проліферації клітин виробники, постачальники, фабрика